Protéomique

Dossier réalisé avec la collaboration de Jérôme Garin, directeur de recherche au sein de la Direction des sciences du vivant du CEA, directeur de l’Institut de recherche en technologies et sciences pour le vivant (IRTSV), directeur de l’unité U1038 (Inserm/CEA/UJF) et coordonnateur de l’infrastructure nationale de protéomique (ProFI - Mars 2013.

La protéomique, c’est l’histoire de la chenille et du papillon. Ces deux organismes apparemment si différents ont exactement le même génome. Ce qui les distingue, ce sont les produits finaux d’expression de leurs gènes, c’est à dire leurs protéines. Cet exemple montre à quel point il est nécessaire, pour comprendre un organisme, de s’intéresser à ses protéines et pas seulement à son génome.

La protéomique consiste à étudier l’ensemble des protéines d’un organisme, d’un fluide biologique, d’un organe, d’une cellule ou même d’un compartiment cellulaire. Cet ensemble de protéines est nommé « protéome ».

Le protéome est une entité dynamique et complexe. Au sein de chaque cellule, le contenu de protéines se modifie en permanence en fonction des conditions intra ou extra cellulaires. De plus, par le biais de réarrangements qui modifient ses fonctions biologiques, un même gène peut donner naissance à plusieurs protéines. Le protéome contient donc un nombre beaucoup plus important de protéines que le génome ne contient de gènes.

L’étude du protéome révolutionne la connaissance du vivant

Les principaux objectifs de la protéomique sont d’identifier et de quantifier les protéines présentes dans un échantillon biologique à un instant T, et d’obtenir des données fonctionnelles : localisation, identification de protéines partenaires, sites de liaison de ligands... Ces données permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliquées dans les grandes fonctions cellulaires. Il est par exemple possible d’étudier des voies de signalisation impliquées dans des processus biologiques ou dans l’apparition de maladies. En comparant les échantillons de personnes en bonne santé et de personnes malades (inclues dans de grandes cohortes), la protéomique permet également de découvrir et valider l’utilisation de biomarqueurs protéiques utiles au dépistage de maladies, au suivi de leur évolution ou encore à l’évaluation de l’efficacité d’un traitement. .

Human Protein Project (HPP)
Un vaste projet international de protéomique, sur le modèle de celui qui existe en génomique, a été lancé en 2011. Piloté par l’Human Proteome Organisation (HUPO), une organisation internationale, il consiste à créer une base de données unique permettant de décrire les protéines correspondant aux 20 300 gènes codants chez l’homme. Les différents pays partenaires de ce projet se sont répartis les chromosomes qu’ils annotent progressivement. La France est en charge du chromosome 14. D’autres volets de ce projet consistent à caractériser les protéomes du plasma, du foie, du cerveau, du système immunitaire, du rein, de l’urine ou encore du système cardiovasculaire. L’hétérogénéité des protéomes d’un individu à l’autre et leur caractère dynamique rendent cet exercice difficile, mais il présente l’avantage de promouvoir la protéomique et de stimuler les coopérations internationales.

La spectrométrie de masse au service de l’étude des protéines

Analyse sur un écran des résultats d'un spectromètre de masse (MALDI/TOF) des cellules tumorales humaines. Unité de recherche Inserm 896. Institut de recherche en cancérologie de Montpellier (IRCM)

Analyse sur un écran des résultats d'un spectromètre de masse (MALDI/TOF) des cellules tumorales humaines. Unité de recherche Inserm 896. Institut de recherche en cancérologie de Montpellier (IRCM)

L’étude des protéines a connu un essor spectaculaire au cours des années 90, avec l’avènement d’appareils - les spectromètres de masse - compatibles avec l’analyse de ces grosses molécules (ce qui valu le prix Nobel de chimie en 2002 à John Fenn et Koichi Tanaka). Jusque-là, les scientifiques utilisaient une méthode chimique qui nécessitait de purifier des quantités importantes de chaque protéine avant de pouvoir en déterminer la séquence en acides aminés. Aujourd’hui, les spectromètres de masse permettent d’analyser des échantillons biologiques complexes, pouvant contenir des milliers de protéines, dont certaines présentes en faible quantité.

La spectrométrie de masse consiste à identifier des molécules en fonction de la mesure précise de leur masse. Pour réaliser une étude protéomique, il faut d’abord digérer les protéines de l’échantillon à étudier grâce à une enzyme, afin d’obtenir des fragments protéiques (ou « peptides ») qui sont solubles dans la solution qui est injectée dans le spectromètre de masse. Ces peptides sont ensuite fragmentés par la machine. Les masses de chaque peptide et des fragments sont mesurées. Elles permettent d’identifier les peptides contenus dans l’échantillon, en comparant les données expérimentales aux données déjà existantes dans des banques.

Les données sont restituées sous une forme que l’on peut comparer à un puzzle. C’est aux scientifiques de reconstituer le puzzle pour retrouver l’identité des protéines qui étaient présentes dans l’échantillon. Ce travail est bien sûr facilité par des logiciels informatiques de plus en plus performants et des bases de données de plus en plus riches.

Collaborer pour progresser toujours plus vite
L’étude d’un protéome très complexe qui contient des milliers de protéines, comme celui du sang, du liquide séminal ou encore du liquide céphalo-rachidien, reste une aventure périlleuse qui nécessite l’expertise et la contribution de plusieurs laboratoires pendant plusieurs années. Trois sites français, localisés respectivement à Grenoble, Toulouse et Strasbourg, mettent actuellement leurs outils d’analyse et leurs données de protéomique en commun, grâce au financement des investissements d’avenir. L’objectif est de partager les expériences, de développer des logiciels et des protocoles communs pour harmoniser les données issues des différentes plateformes, puis d’élargir ce travail à d’autres sites en France et à l’étranger.

Image moléculaire du transit des spermatozoïdes dans l'épididyme de rat en imagerie par spectrométrie de masse MALDI

Image moléculaire du transit des spermatozoïdes dans l'épididyme de rat en imagerie par spectrométrie de masse MALDI

Grâce aux spectromètres de masse les plus récents, il devient possible d’étudier des protéines entières, sans avoir à les digérer préalablement. Cette pratique devrait connaître un essor important au cours des années à venir.

L’imagerie par spectrométrie de masse MALDI permet par ailleurs de faire du « profiling » du contenu protéique. L’appareil est par exemple capable de balayer une coupe d’échantillon et de restituer les masses mesurées sous forme de signaux de couleurs avec une très bonne résolution. Chaque protéome possède ainsi un profil sous forme de pics de couleurs.

En cancérologie, le fait de comparer le profil issu des cellules d’un patient présentant une tumeur avec celui de personnes saines peut par exemple aboutir à la mise au point d’un protocole permettant de détecter une tumeur maligne.

Ce dispositif est également de plus en plus utilisé en milieu hospitalier dans le domaine de l’infectiologie, pour caractériser des agents pathogènes en fonction de leur « profil MALDI ».

 

La protéomique pour comprendre, détecter et suivre les maladies

La protéomique permet d’étudier un échantillon biologique de façon globale, sans a priori sur les protéines susceptibles d’y être présentes. Cette approche permet d’obtenir une liste de protéines avec des données quantitatives. C’est ce qu’a fait l’équipe de Charles Pineau (Inserm U1085) pour identifier des marqueurs de la spermatogenèse. Les chercheurs ont effectué une analyse protéomique du liquide séminal et ont identifié 699 protéines parmi lesquelles au moins trois ont des niveaux d’expression associés à la fertilité ou, au contraire, l’infertilité.

De façon complémentaire, la protéomique permet également de réaliser des analyses ciblées qui visent à quantifier une protéine d’intérêt dans différents échantillons, afin d’étudier son rôle dans un système biologique. C’est par exemple ce qui est fait pour valider l’intérêt un biomarqueur dont le niveau d’expression est corrélé à un état physiologique normal ou pathologique, ou encore à la réponse à un traitement. Ce type d’approche permet aussi de suivre l’évolution d’un groupe de protéines pendant plusieurs semaines pour établir un profil d’expression en réponse à une perturbation. Cette stratégie a par exemple été utilisée pour étudier les effets du docetaxel, un traitement anti-cancéreux. Les analyses ciblées permettent enfin d’identifier des complexes de protéines. C’est ainsi que l’équipe du Pr Aleksander Edelman (Inserm U845) a pu mettre en évidence une protéine jouant un rôle clé dans la mucoviscidose : la kératine 8. Les chercheurs ont montré que, chez une majorité de patients, la kératine 8 se lie à la protéine responsable de la maladie (CFTR) et altère son fonctionnement.

La découverte de biomarqueurs, objectif majeur de la protéomique

Plaque Ciphergen pour la recherche de biomarqueurs. Plateforme de spectrométrie de masse et protéomique de l'unité 891

Plaque Ciphergen pour la recherche de biomarqueurs. Plateforme de spectrométrie de masse et protéomique de l'unité 891 "Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille", CRCM, Institut Paoli-Calmettes, Marseille

Même si les domaines d’application de la protéomique sont vastes, la découverte de biomarqueurs permettant de dépister des maladies, de suivre leur évolution ou l’efficacité d’un traitement est actuellement le principal moteur de développement de cette science. De tels biomarqueurs sont déjà connus, tel le PSA dans le cancer de la prostate, mais ils sont encore rares car ils doivent être sensibles, spécifiques et leur utilisation doit être validée sur de grandes cohortes de patients.

L’utilisation d’association de biomarqueurs paraît prometteuse pour détecter des pathologies multifactorielles. En 2010, les autorités de santé américaine ont par exemple approuvé un test fondé sur la détection de cinq biomarqueurs protéiques sanguins afin d’évaluer le volume de la tumeur maligne de l’ovaire avant chirurgie (OVA1). Le projet européen DECanBio, coordonné par le Dr Jérôme Garin (CEA/Inserm/UJF U1038), va également dans ce sens. Il consiste à découvrir et valider l’utilisation de biomarqueurs urinaires permettant de détecter de façon précoce des récidives du cancer de la vessie. Pour cela, les chercheurs étudient le protéome urinaire de personnes atteintes de ce cancer, identifient des biomarqueurs potentiels et confirment leur validité dans une large cohorte de patients issue de deux pays européens et atteints de pathologies pouvant être confondues avec le cancer de la vessie. L’objectif est de s’assurer de la spécificité des biomarqueurs découverts.

Ces biomarqueurs sont utiles en cancérologie mais également dans bien d’autres domaines thérapeutiques. Ainsi, l’équipe de Virginie Brun (CEA/Inserm/UJF U1038) a validé l’intérêt du dosage sérique de cinq biomarqueurs de l'infarctus du myocarde ainsi que celui du dosage sérique extrêmement sensible d'une toxine staphylococcique (entérotoxine A) responsable de plus de 70 % des intoxications alimentaires en France.

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